하기에서는site-directedmutagenesis의방법에대해알아보겠습니다.

1.   주요준비물

 

    Templateplasmid:Mutagenesis하고자하는특정DNA서열(target)이포함된plasmid DNA

    MutagenicPrimer:변경하고자하는뉴클레오타이드를포함하는primer로설계하고,길 이는대략25~45 bp사이로제작하며, Tm(녹는온도)은55~65°C로제작

            High-fidelityDNApolymerase:돌연변이없이정확히증폭하기위해PfuDNA polymerase 사용

    dNTPsmixture(디옥시뉴클레오타이드):DNA합성을위한dATP,dTTP,dCTP,dGTP(10mM)

    10XPCRbuffer:DNApolymerase에적합한완충액

    DpnIrestrictionenzyme:메틸화된plasmidDNA(템플릿DNA)제거

    Competentcells

2.  PCR시료준비

 

3.  PCR반응조건

다음의조건으로PCR을실시합니다.

4.  Templateplasmid제거

 

PCR이완료된후에는증폭된DNA산물을제외한templateplasmid제거를위해,DpnI처리를 실시합니다.일반적으로1 μl의Dpn I을PCR product에첨가한다음에37°C에서1시간동안 Incubation 합니다. 

5.  Transformation

 

DpnI처리까지끝낸PCRproduct는1~10μl를competentcell에첨가한다음제조사의 protocol에맞게transformation 을실시합니다.

이 기본적인site-directed mutagenesis를통해원하는 DNA 서열을돌연변이시킬수있습니다. 단, PCR조건은템플릿과프라이머에따라최적화가필요할수있습니다.