세포 배양 실험에서의 오염은 실험 결과의 신뢰도를 크게 저해할 수 있는 치명적인 문제로 주로 세균, 곰팡이, 마이코플라즈마, 바이러스, 교차 오염 등 다양한 형태로 발생합니다. 이러한 오염은 세포의 성장 속도와 형태를 변화시키고, 유전자 발현, 대사 활동, 단백질 생산 등에 예기치 못한 영향을 줄 수 있어 연구 결과의 왜곡을 초래할 수 있습니다. 따라서 정기적인 오염 검사와 철저한 무균 조작, 오염 시 신속한 폐기 및 소독 조치가 필수적입니다. 본 글에서는 세포 오염의 주요 유형과 대처 방안에 대하여 간략히 살펴보겠습니다.

오염의 종류

1.   세균

세균에 의한 오염은 배양 세포의 육안 검사를 통해 세균 감염 후 수일에서 쉽게 발견됩니다. 세균에 감염된 배양 세포는 일반적으로 탁하게 보이고 표면에 얇은 막이 관찰될 수 있으며 배지의 pH의 급격한 하락도 종종 관찰됩니다. 낮은 배율의 현미경으로 박테리아는 세포 사이에서 움직이고 있는 작은 알갱이처럼 관찰되고 고배율의 현미경으로 관찰하면 개별 세균의 형태를 확인할 수 있습니다.

* 아래의 이미지는 대장균에 오염된 접착성 293 배양 세포.

 2.  곰팡이

곰팡이는 진핵 미생물의 균사라는 다세포성 필라멘트로 성장합니다. 오염의 초기에는 배양액의 pH는 안정 상태를 유지하지만, 오염이 심하게 진행되면 pH는 급격히 상승하고 배양액이 혼탁해 지는 경향이 있습니다. 현미경에서 균사체는 일반적으로 얇고 얇은 필라멘트 모양으로 보이지만, 조밀 한 포자 덩어리로 관찰 될 수도 있습니다. 많은 종류의 곰팡이 포자는 매우 엄격한 생육에 적합하지 않은 환경을 휴면 상태로 살아남아 성장에 적합한 환경이 갖춰진 경우에만 활성화됩니다.

 3.  효모

효모는 박테리아 계에 속하는 단세포성 진핵 미생물로 크기는 1μm 에서 40 μm 의 범위에 해당됩니다. 세균에 의한 오염뿐만 아니라 효모에 의해 오염된 배양 세포는 오염이 진행되면 배양액이 심하게 탁해집니다. 효모에 오염 된 배양액의 pH는 오염이 심하게 진행하기 전까지는 거의 변화하지 않지만 오염이 진행됨과 동시에 상승합니다. 현미경으로 관찰 시 개별 효모가 난형 또는 구형의 입자로 관찰되고 더욱 작은 입자로 나타나는 경우도 있습니다.

*아래의 이미지는 효모에 의해 오염된 접착성 293 배양 세포.

 4.  바이러스

바이러스는 미세한 감염성 물질이며, 숙주 세포의 기구를 이용하여 재생합니다. 지극히 미세한 크기 때문에, 배양 중의 검출 및 세포 배양 실험실에서 사용되는 시약에서의 제거는 매우 어려울 수 있습니다. 대부분의 바이러스는 숙주에 대한 요구 가능성이 매우 높고, 일반적으로 숙주 이외의 종류의 세포 배양에 악영향을 미치지 않습니다. 그러나 바이러스에 감염된 세포 배양물을 사용하는 것은 특히 인간이나 영장류의 세포가 실험실에서 배양되는 경우에는 실험 종사자에게 심각한 건강 위험을 초래할 수 있습니다. 세포 배양의 바이러스 감염은 전자 현미경 관찰, 항체를 이용한 면역 염색, ELISA 분석, 또는 적절한 바이러스에 대응한 프라이머를 이용한 PCR 법에 의해 감지할 수 있습니다.

 5.  Mycoplasma

Mycoplasma 는 세포벽을 갖지 않는 단순한 박테리아로 자기 복제 가능한 최소의 미생물 인 것으로 간주됩니다. Mycoplasma 는 매우 작은 크기 (보통 1 μm 미만) 때문에 매우 고밀도로 성장 세포 배양을 저하 시키게 될 때까지 감지하는 것은 어려우며, 그런 상태가 될 때까지 감염의 시각적 징후가 전혀 보이지 않는 경우가 종종 있습니다. 성장 속도가 느린 Mycoplasma 의 일부는 세포 사멸을 유발하지 않고 세포 배양 중에 계속 존재하기도 합니다. 그러나 그 경우에도 배양중인 숙주 세포의 활동과 신진 대사에 영향을 줄 수 있습니다. 만성적인 Mycoplasma 감염은 세포 증식 속도 저하, 포화 밀도의 저하, 부유 배양 물의 응집으로 나타나기도 하지만, Mycoplasma 감염을 감지하는 유일한 방법은 정기적으로 형광 염색 (예: Hoechst33258), ELISA, PCR, 면역 염색 또는 미생물학적 분석을 사용하여 검사 할 수 있습니다.

*아래의 이미지는 Mycoplasma 검출 키트를 사용한 것이며 A는 Mycoplasma 에 감염되지 않은 세포, B와 C는 Mycoplasma 에 감염된 배양세포.

오염 발생 후 대처 방법

세포의 상태가 평상시와 다른 것이 관찰되어 오염이 의심될 시

1)    배지의 색이 평상시와 다르거나 배지가 탁하거나 큰 이물질이 존재하는 것을 확인합니다.

2)    고배율의 현미경으로 자세히 관찰하여 오염여부를 판단합니다.

3)    오염으로 판단 시 Incubator 혹은 clean bench 내에서 뚜껑을 열지 말고 autoclave bag에 넣어 bag의 입구를 막고 autoclave 과정 후, 혹은 곧바로 폐기물 통에 버려 처리합니다.

4)    오염원을 완전히 찾는 것은 거의 불가능하기 때문에 오염된 실험 시 사용한 것들은 모두 폐기 처리합니다.

5)    70% EtOH과 UV lamp를 사용하여 전체적으로 살균 처리합니다.

6)    실험실을 함께 사용하는 동료에게 오염 사실을 알려 다른 곳에 오염을 확장시키는 것을 막습니다.

* 아래의 이미지는 세포 오염의 예시 사진임.