실험 목적에 맞는 계대배양: 주기, 농도 설정 가이드

세포를 계속해서 유지하려면 일정한 간격으로 계대배양(passaging)을 진행해야 합니다. 계대배양은 세포가 과밀해지는 것을 방지하고 일정한 밀도로 배양 용기에 분주하는 과정으로, 세포의 건강을 유지하고 실험 재현성을 확보하는 데 필수적입니다. 지금부터 세포 배양을 효과적으로 유지하기 위해 반드시 알아두어야 할 핵심 사항들을 정리해 보겠습니다.

 계대배양(Passaging)의 필요성

✔세포 과밀 방지 (Contact inhibition 방지)

✔세포 대사산물 축적에 따른 독성 및 환경 변화 방지

✔세포 성장 및 증식 유지

✔실험 조건의 일관성 확보

 계대배양(Passaging) 주기 설정 시 주요요소

1. 컨플루언스 (Confluency)

 1) 세포가 배양 용기 표면을 덮은 정도를 말함..

 2) 추천 계대배양 시점: Plate에 세포가 70~90% 정도 찼을 때가 적당함.

2. 세포 성장 속도

 1) 세포가 분열하여 개수가 2배로 증가하는데 걸리는 시간을 doubling time이라고 함.

 2) 세포의 종류 및 배양 조건에 따라 doubling time이 각자 다르기 때문에 실험 계획 시 세포 종류별 평균 doubling time 참고할 것.

 3) 추천 계대배양 시점: 2~5일마다 한 번씩이 적당하며 plate 면적과 doubling time을 고려할 것.

3. 배지 색 변화

 1) 배지에 Phenol Red가 함유되어 있는 경우 빨간색이었던 배지가 노란색으로 변하면 pH 감소를 의미하고 이는 배지에 대사산물이 축적이 많이 되었다는 뜻.

 2) 추천 계대배양 시점: 배지가 노란색으로 변하기 직전이 적당하며 계대배양하기에 세포수가 적다면 배지만 교체하는 것을 추천

4. 세포 모양 (Morphology) 변화

 1) 세포가 과밀 상태가 되거나 분화 혹은 오염되면 세포 모양이 변함.

 2) 추천 계대배양 시점: 세포의 모양이 변화하기 전이 적당하며 건강한 세포 모양은 검색 후 참고할 것.

 계대배양(Passaging) 시 세포 Seeding할 농도 설정법

세포실험을 계속해서 진행하다 보면 “며칠 계대배양할 때 세포를 얼마 정도로 깔면 적당히 차더라”라는 자기만의 감각이 생길 것입니다. 하지만 경험이 쌓이기 전 누구에게나 처음은 있고, 어느 정도가 적당한 양으로 세포를

seeding 한 건지 모르겠는 사람들을 위해 설명드리겠습니다.

우선 세포 seeding할 농도를 설정하기 전 아래의 4가지를 알아야 합니다.

1. 내가 Seeding할 plate의 면적

2. 내가 Seeding할 세포의 적정 밀도 (cells/cm²)

3. 내가 Seeding할 세포의 평균 doubling time

4. 세포 키우는 기간

※ 세포의 적정 밀도, doubling time 및 plate의 면적은 논문에서 찾아보거나 plate나 cell을 구매한 홈페이지를 보면 대부분 게재되어 있습니다.

출처 : SPL

출처 : ATCC

이해를 돕기 위해 아래와 같은 상황을 가정하여 설명하겠습니다.

[예시] A549 세포를 90mm dish(Cat. 11090)에 계대배양하여 3일 후에 사용 예정.

세포를 위의 조건으로 계대배양하기로 하였다면 앞서 말했던 4가지를 찾고 설정해야 합니다.

1. 내가 Seeding할 plate의 면적 : 57.5 cm²

2. 내가 Seeding할 세포의 적정 밀도 : 5×10⁴ cells/cm²

3. 내가 Seeding할 세포의 평균 doubling time : 22 hrs

4. 세포 키우는 기간 : 3일

1) 우선 3일 후 실험을 위해 배양 용기 전체에서 목표하는 세포 수()를 구해야 합니다. 이는 제가 설정한 세포의 밀도 와 배양용기의 면적을 곱하면 구할 수 있습니다.

즉, 3일 후 약 287만 개의 세포가 필요하다는 뜻입니다.

2) 3일은 72시간이며 이를 doubling time으로 나누면 72/22 = 3.27

즉, A549세포는 3일간 3.27번의 doubling을 거친다는 것입니다.

3) 따라서 2.88 X 10^6에서 역순으로 3.27번의 doubling time을 거슬러 올라가면 처음에 seeding해야 할 농도가 나옵니다.

즉, 처음에 약 298,000개의 세포를 Seeding 하면 3일 후 목표 밀도(5×10⁴ cells/cm²)에 도달할 것으로 예상됩니다.

하지만 이는 어디까지나 이론 상이기 때문에 실험자들은 이를 바탕으로 여러 번 반복 실험하여 최적화된 세포 수를 찾길 바랍니다.

 실험 팁 및 주의사항

✔트립신 과다 처리 방지

- 트립신은 단백질 분해 효소라서 너무 오래 반응하면 세포 손상 가능성이 있음

- 보통 1~5분 정도 반응 후 중지

✔세포 덩어리(clumping) 최소화

- 피펫팅을 너무 강하게 하면 세포가 손상될 수 있으니 부드러운 피펫팅으로 덩어리를 풀어야 함

✔컨플루언스(confluency) 확인

- 너무 과밀하면(>90%) 세포 분열 속도 저하 및 노화 가능

- 너무 낮은 밀도(<30%)에서 배양하면 부착이 잘 안될 수 있음

- 70~90% confluent가 되면 계대배양 진행

✔배지 교환과 세포 상태 점검

- 계대배양 직후 세포가 균일하게 분포되었는지 확인

- 계대배양 후 24시간 내에 세포가 잘 부착했는지 확인

- 배지 색이 급격히 변하거나 탁해지는지 관찰 → 오염 가능성 점검

언제나 세포 종류에 맞는 최적화된 프로토콜을 따라야 하며, 무균 환경을 유지하면서 세포를 부드럽게 다루는 연습을 하다 보면 높은 재현성과 정밀도를 갖춘 결과를 얻게 될 것입니다.

성공적인 실험을 기원합니다!