유전자 도입 기술 (Transfection 및 Transduction) 실험 프로토콜

Transfection은 세포 내로 외부 유전자(DNA, RNA, 단백질 등)를 전달하는 기술로, 유전자 발현 연구, 단백질 생산, 유전자 치료 등 다양한 생명과학 연구에 활용됩니다.

방법에 따라 일시적(transient) 또는 영구적(stable) 유전자 발현이 가능합니다.

1.    Transfection (Liposome-based & Polymer-based) 방법

n  특징

1)      장점: 간단하고 빠르며, 다양한 세포에 적용 가능

2)      단점: 일부 세포에서는 낮은 효율, 세포 독성 가능

STEP 0: 준비물

l  트랜스펙션 시약 (예: Lipofectamine, WelFect 등)

l  DNA 또는 RNA

l  FBS-free 배지 (Opti-MEM, TOM Medium 등)

l  배양 중인 세포 (50~80% confluency 권장)

l  24-well / 6-well / 10 cm dish (세포 밀도에 따라 선택)

STEP 1: 세포 준비

1)     세포를 적절한 밀도로 plating하여 50~80% confluency에 도달하도록 배양합니다.

STEP 2: 트랜스펙션 시약과 DNA/RNA 혼합

1)     FBS-free 배지에 트랜스펙션 시약을 적정 농도만큼 사용하여 희석합니다.

2)     별도의 튜브에서 DNA 또는 RNA를 FBS-free 배지에 필요한 농도만큼 사용하여 희석합니다.

3)     두 용액을 혼합 후 실온에서 10~20분 동안 incubation 합니다.

STEP 3: 세포에 도입

1)     준비된 혼합 용액을 배양 중인 세포에 처리합니다.

2)     4~6시간 후 FBS가 포함된 배양 배지로 교체를 진행합니다.

STEP 4: 발현 및 분석

1)     24~48시간 배양 후 형광현미경, Western blot, qPCR, Flow cytometry 등을 이용하여 발현을 확인합니다.

2.    Electroporation (전기 천공법)

n  특징

1)     강한 전기 펄스를 이용해 세포막에 일시적 구멍을 형성하여 유전물질 전달한다.

2)     장점: 고효율, 바이러스 없이 다양한 세포에 적용 가능 (특히 줄기세포, Primary 세포)

3)     단점: 세포 독성이 높고, 최적화 필요

n  실험 단계

1)      세포를 수확하고 세포 침전물(pellet)을 생성한다.

2)      PBS 또는 electroporation buffer를 사용하여 세포를 resuspension 한다.

3)      DNA/RNA 혼합 후 electroporation cuvette에 옮긴다.

4)      Electroporator를 이용하여 최적의 조건으로 pulse를 적용한다.

5)      트랜스펙션된 세포를 회수하여 배양한다.

6)      72시간 이후 발현 및 분석을 진행한다.

3.    바이러스 매개 유전자 전달 (Lentivirus, AAV, Retrovirus)

①    Lentivirus (렌티바이러스)

[1] Lentivirus 생산 (HEK293T 기반 패키징 시스템)

STEP 1: 플라스미드 준비 (3세대 벡터 시스템 사용)

1)     유전자 전달 벡터 (pLenti) → 타겟 유전자 포함

2)     패키징 플라스미드 (pMDLg/pRRE, pRSV-Rev) → 바이러스의 구조 단백질 발현

3)     Envelope 플라스미드 (pVSV-G) → 바이러스의 감염성을 결정

STEP 2: HEK293T 세포 트랜스펙션

1)     Lipofectamine 2000 또는 PEI를 사용하여 플라스미드 트랜스펙션을 진행한다.

2)     6시간 후 배지를 DMEM + 10% FBS로 교체한다.

STEP 3: 바이러스 수집 및 농축

1)     48~72시간 후 배양 배지를 수집하여 0.45 μm 필터로 여과한다.

2)     Ultracentrifugation 또는 Lenti-X Concentrator를 이용해 농축한다.

3)     바이러스 역가 측정 (qPCR, ELISA, FACS 이용)

[2] Lentivirus를 이용한 감염 (Transduction)

STEP 1: 타겟 세포에 바이러스 처리

1)     MOI(Multiplicity of Infection) 결정 후 적정량의 바이러스를 첨가한다.

2)     Polybrane (8 μg/mL) 또는 DEAE-dextran을 사용하면 감염 효율이 증가한다.

3)     12~24시간 후 배지를 신선한 배지로 교체한다.

STEP 2: 선별 및 안정 발현 확인

1)     항생제 저항성 유전자 (Puromycin, Blasticidin 등)를 이용해 감염된 세포만 선별

2)     Western blot, qPCR, Flow cytometry 등을 이용해 유전자 발현 확인

②    AAV (Adeno-associated Virus, 아데노 연관 바이러스)

[1] AAV 생산 (HEK293T 시스템)

STEP 1: 플라스미드 준비

1)     유전자 전달 벡터 (pAAV-유전자) → 타겟 유전자 포함

2)     포장 플라스미드 (pHelper, pRep/Cap) → AAV 바이러스 구조 단백질 제공

STEP 2: HEK293T 세포 트랜스펙션

1)     Lipofectamine 2000 또는 PEI를 사용하여 플라스미드 트랜스펙션을 진행한다.

2)     48~72시간 동안 배양한다.

STEP 3: 바이러스 정제 및 농축

1)     Freeze-thaw cycle (동결-해동 반복)로 바이러스를 방출한다.

2)     CsCl gradient ultracentrifugation 또는 FPLC로 정제한다.

3)     Titration (qPCR 또는 ELISA) 후 바이러스 역가 결정

[2] AAV 감염 (Transduction)

STEP 1: 타겟 세포에 AAV 처리

1)     MOI(Multiplicity of Infection) 결정 후 적정량의 바이러스를 첨가한다.

2)     감염된 세포를 24~72시간 배양한다.

STEP 2: 유전자 발현 분석

1)     대부분 일시적 발현이며, 일부는 장기 발현 가능하다.

2)     형광현미경, Western blot, qPCR, Flow Cytometry를 이용해 확인한다.

③    Retrovirus (레트로바이러스)

[1] Retrovirus 생산

STEP 1: 패키징 플라스미드 준비

1)     유전자 전달 벡터 (pMXs, pBabe 등) → 타겟 유전자 포함

2)     Gag-Pol, Env 플라스미드 → 바이러스의 구조 단백질 제공유전자

STEP 2: 패키징 세포 (GP2-293, Phoenix 등) 트랜스펙션

1)     Lipofectamine 2000 또는 PEI를 사용하여 플라스미드 트랜스펙션을 진행한다.

STEP 3: 바이러스 수집

1)     24~48시간 후 바이러스 배지를 수집 후 0.45 μm 필터로 여과한다.

2)     Ultracentrifugation으로 농축 가능

[2] Retrovirus 감염 (Transduction)

STEP 1: 타겟 세포에 바이러스 첨가

1)     Polybrene (4~8 μg/mL) 사용하여 감염 효율을 증가시킨다.

2)     12~24시간 후 배지 교체한다.

STEP 2: 유전자 발현 확인 및 선별

1)     형광 단백질, 항생제 저항성 유전자 등을 이용해 감염된 세포를 선별한다.

2)     Western blot, qPCR, Flow cytometry 등을 이용해 유전자 발현을 확인한다.

3)      

주의사항 및 문제 해결법